何謂常規(guī)反相色譜柱？
在硅膠或雜化基質(zhì)顆粒上鍵合了如C18、C8、C4或苯基等鍵合相的色譜填料所裝填的色譜柱，按反相色譜條件進(jìn)行操作和分離。反相是液相色譜中常使用的分離模式，而C18柱是常使用的反相色譜柱之一。
新色譜柱開啟和安裝的推薦步驟：
使用新鮮潔凈的水與乙腈。沖洗系統(tǒng)，確保系統(tǒng)干凈，不含任何緩沖鹽和污染物。
取用色譜柱時避免磕碰掉落。
將色譜柱入口端連接到系統(tǒng)上，柱出口端先不要連接，色譜柱身上有箭頭標(biāo)明正確流向。
在0.1 mL/min流速條件下用純乙腈潤洗色譜柱，然后在2分鐘內(nèi)將流速升至0.5 mL/min。
當(dāng)溶劑均勻的從柱出口端流出，停流速，將色譜柱出口端接到系統(tǒng)檢測器上（這樣可以避免氣泡進(jìn)入檢測系統(tǒng)，并且可快速達(dá)到基線平衡）。
重啟流速，按照步驟4的方法逐漸提高流速，至常規(guī)分析時所使用的流速。
參考柱效測試報告中的方法，使用該流動相條件平衡色譜柱，通常需要使用5-10倍柱體積的流動相，直至壓力與基線穩(wěn)定。
測試柱效。如果沒有柱效測試報告中的分析物，請聯(lián)系沃特世化學(xué)消耗品部門尋求支持，使用合適的濃度與進(jìn)樣量。柱效結(jié)果略低于柱效測試報告屬正常情況。如結(jié)果明顯偏低、峰形拖尾，提示色譜柱和/或所使用的液相系統(tǒng)處于非理想狀態(tài)，需要進(jìn)行故障排查。
當(dāng)使用2.1 mm內(nèi)徑色譜柱時，建議優(yōu)化系統(tǒng)以減少譜帶展寬，包括：使用檢測器微量流通池，減少進(jìn)樣器loop環(huán)體積，使用較小內(nèi)徑（如0.005''或0.12 mm）的系統(tǒng)管路。并確保管路與色譜柱連接恰當(dāng)、無死體積。
當(dāng)使用小顆粒填料（如2.5 μm）短柱進(jìn)行高效快速分離時，需要考慮以下因素：
確保管路與色譜柱連接恰當(dāng)、無死體積，盡量優(yōu)化系統(tǒng)減少譜帶展寬；
提高采樣頻率至10點/秒以上；
較小粒徑的色譜柱產(chǎn)生的柱壓較高，而較小粒徑要達(dá)到理想色譜效率所需的線速度較高，請根據(jù)所用LC系統(tǒng)的實際情況調(diào)節(jié)流速；
可使用較高的柱溫來補償小顆粒造成的壓力升高，例如40?C。使用雜化顆粒反相色譜柱時，可使用45?C或更高。
進(jìn)行實際樣品分析的推薦步驟：
確保流動相潔凈，每隔24-48小時就應(yīng)新配水相流動相，并同時更換或仔細(xì)清洗流動相溶劑瓶，以避免流動相長菌。確保實驗室純水系統(tǒng)工作正常。
確保樣品不含顆粒型雜質(zhì)。如樣品過臟，或有微粒存在，需要考慮適合的樣品制備方法。在使用樣品過濾器時，確保濾膜為0.22 μm，且與樣品溶劑完全兼容（不發(fā)生溶解）。也可考慮使用高速離心法去除顆粒性雜質(zhì)，例如8000 rpm轉(zhuǎn)速以上離心20分鐘后，移取樣品上清液進(jìn)樣。
確保樣品溶液與流動相條件兼容，進(jìn)樣后不會發(fā)生沉淀、或溶劑不互溶情況。通常使用流動相或比流動相洗脫強度弱的溶液（即有機溶劑比例較低）溶解或稀釋樣品，這樣可以獲得優(yōu)異的峰形和檢測靈敏度。
如系統(tǒng)在線混合生成流動相，預(yù)先檢查流動相各組分的兼容性。例如，當(dāng)磷酸鹽緩沖液與高濃度乙腈（例如≥70%）混用時，可能發(fā)生鹽析出。
了解色譜柱的操作使用限度。如果所使用的流動相條件、柱溫、以及樣品溶液條件，不利于色譜柱壽命時，請使用保護(hù)柱以延長柱壽命。
在使用流動相進(jìn)行柱平衡之前，如果流動相中含有可能析出的緩沖鹽，先使用5倍柱體積的有機溶劑-水溶液進(jìn)行過渡。例如，在使用40/60 甲醇/磷酸鹽緩沖液流動相之前，先使用5倍柱體積的40/60 甲醇/純水溶液沖洗色譜柱。
在常規(guī)分析過程中，每針或間隔若干針清洗柱內(nèi)可能積累的污染物。完成分析后，徹底清洗色譜柱，除去柱內(nèi)緩沖鹽和污染物。
在色譜柱使用過程中，定期進(jìn)行柱效測試，記錄塔板數(shù)與壓力，從而追蹤監(jiān)控色譜柱的性能變化。柱效測試方法應(yīng)固定。
反相色譜柱應(yīng)保存于合適的高比例或100%有機相（如乙腈或甲醇）中。如色譜柱使用于高溫或極端PH條件，或停用色譜柱超過72小時，用100%乙腈保存色譜柱。
使用原配的柱堵頭，確保堵頭擰緊以避免柱內(nèi)溶劑揮發(fā)。取放色譜柱時避免磕碰掉落。
柱清洗與再生的推薦步驟：
壓力升高，色譜柱峰形發(fā)生變化如出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾、肩峰甚至峰分岔，分離度降低，這些都強烈提示色譜柱受到污染?？刹捎靡韵虏襟E處理：
如系統(tǒng)接有在線過濾器和保護(hù)柱，首先排查在線過濾器與保護(hù)柱，進(jìn)行更新替換。日常操作中，當(dāng)壓力升高10%或柱效降低10%時，就應(yīng)考慮更換在線過濾器和/或保護(hù)柱。
使用高比例的有機溶劑進(jìn)行沖洗（請注意避免鹽析出，通常可使用梯度升高法，然后維持在高比例甚至100%有機溶劑條件下）。此操作通常可洗去大部分污染物。
如有機溶劑清洗不能解決問題，可采用如下方法進(jìn)行色譜柱的清洗和再生。根據(jù)樣品性質(zhì)以及你所了解的污染物性質(zhì)選擇清洗方法，用20倍柱體積（即，對于4.6x250 mm柱，相當(dāng)于80 mL）的HPLC級溶劑清洗色譜柱，將流動相溫度升至35-55?C可提高清洗效率。
極性樣品 | 非極性樣品 | 蛋白質(zhì)類樣品 |
1.水 | 1.異丙醇* | 選擇1：連續(xù)進(jìn)幾針DMSO（二甲基亞砜），以溶解柱頭析出樣品。 |
2.甲醇 | 2.THF** | |
3.THF** | 3. 二氯甲烷** | 選擇2：10-90% B梯度沖洗，其中A為0.1% TFA水溶液，B為0.1% TFA乙腈。 |
4.甲醇 | 4. 正己烷** | |
5.水 | 5. 異丙醇* | 選擇3：使用7M鹽酸胍或7M尿素水溶液(配制后膜過濾)沖洗色譜柱，促使柱上吸附蛋白樣品變性溶解。 |
6.流動相 | 6. 流動相 |
* 注意防止緩沖鹽析出，可調(diào)整為適當(dāng)比例的異丙醇和水的混合溶液
** 除非確保您的系統(tǒng)與四氫呋喃和正己烷完全兼容，否則四氫呋喃或正己烷只有在色譜柱無法用反相有機溶劑如乙腈清洗干凈時才考慮使用。降低流速及操作溫度，并盡量減少系統(tǒng)在四氫呋喃和正己烷中的暴露時間。
可以考慮對色譜柱進(jìn)行倒沖，特別是當(dāng)問題表現(xiàn)為壓力急劇升高，提示有顆粒型物質(zhì)直接堵塞于色譜柱入口端篩板處時。操作時，將色譜柱倒接，并與檢測器斷開。使用低流速0.2 ml/min，進(jìn)行過夜沖洗，并封堵檢測器入口及出口端以免溶劑揮干產(chǎn)生氣泡。甚或，將色譜柱小心的打開，直接更換柱入口端篩板。注意！這類操作需要技巧，僅作問題確實無法得到有效解決時的最后嘗試，或供某些經(jīng)驗豐富的分析操作人員參考使用。
